免疫熒光實(shí)驗(yàn)服務(wù)

　　一、服務(wù)介紹

　　免疫熒光實(shí)驗(yàn)服務(wù)：細(xì)胞化學(xué)是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理，先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光素制成熒光標(biāo)記物，再用這種熒光抗體（或抗原）作為分子探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原（或抗體）。在細(xì)胞或組織中形成的抗原抗體復(fù)合物上含有熒光素，利用熒光顯微鏡觀察標(biāo)本，熒光素受激發(fā)光的照射而發(fā)出明亮的熒光（黃綠色或桔紅色），可以看見熒光所在的細(xì)胞或組織，從而確定抗原或抗體的性質(zhì)、定位，以及利用定量技術(shù)測定含量。

　　二、實(shí)驗(yàn)原理

　　將不影響抗原抗體活性的熒光色素標(biāo)記在抗體（或抗原）上，與其相應(yīng)的抗原（或抗體）結(jié)合后，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)一種特異性熒光反應(yīng)。

　　三、實(shí)驗(yàn)流程

　　免疫熒光實(shí)驗(yàn)服務(wù)單標(biāo)記方法

　　單標(biāo)記是指只標(biāo)記一種蛋白質(zhì)分子，方法比較簡單，只要按照染色步驟去做，通常不存在太多的問題。但要注意固定液的選擇，固定液選擇的合適與否，可能會(huì)直接影響染色結(jié)果。具體染色方法如下。

　　1、所需材料與試劑

　　a,培養(yǎng)在蓋玻片或玻璃培養(yǎng)皿中融合程度達(dá)到60%-70%的細(xì)胞。

　　b,一抗、FITC或TRITC標(biāo)記的二抗。

　　c,4%多聚甲醛固定液或冷丙酮固定液(-20℃預(yù)冷20min)。

　　d,封閉液。

　　e,0.01mol／LPBS緩沖液。

　　2、染色方法

　　a,取出培養(yǎng)有細(xì)胞的蓋玻片或glass-bottom培養(yǎng)皿，用0.01MPBS洗2-3遍。

　　b,加入0.3%的Tritonx-100,37℃,30rain

　　c,加入4%多聚甲醛試問固定30min或冷丙酮4℃固定10min。

　　d，正常阻斷血清1:20封閉試問20-30min，抑制IgG的非特異性結(jié)合。阻斷血清選擇與二抗同一種屬的正常血清。

　　e,去掉正常血清，直接加入一抗，37℃孵育1h或4℃過夜。抗體以0.01mo/LPBS稀釋(理想的抗體濃度需經(jīng)試驗(yàn)而定)。

　　f,0.3%TritonX-100洗5min，0.01mol/IPBS洗5min，0.3%TritonX5min，0.01MPBS洗5rain。

　　g,加入FITC-二抗或TRITC-二抗，37℃，孵育1h。

　　h,0.3%TritonX-100洗5rain，0.01mol/LPBS洗5min，0.3%TritonX5min，0.01mol/LPBS洗5min，用濾紙吸干。

　　i,90%甘油(PBS配制)封片。

　　j,激光掃描共焦顯微鏡下觀察，或于4℃避光保存。

　　雙標(biāo)記方法：是指同時(shí)標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)兩種蛋白質(zhì)分子，當(dāng)懷疑某種配體與已知受體結(jié)合后可用此方法加以證明。此方法稍微復(fù)雜一些，應(yīng)注意所用的一抗是來自不同種屬動(dòng)物的兩種特異性抗體(例如：A抗體為多克隆抗體，來自家兔；B抗體為單克隆抗體，來自小鼠)。其次，兩種二抗所帶熒光素的發(fā)射光不應(yīng)重疊，且盡量遠(yuǎn)離，通?？梢赃x擇FITC和TRITC、Alex488和TRITC、FITC和Cy5，或Cy3和Cy5等來組合。通常情況下，染色時(shí)兩種一抗可以同時(shí)孵育，然后可以同時(shí)孵育兩種二抗。但當(dāng)染色結(jié)果一種顏色非常弱，而另一種顏色比較強(qiáng)時(shí)，應(yīng)考慮先孵育顏色較弱的二抗。其他步驟同免疫熒光單標(biāo)記。

　　四、客戶提供

　　細(xì)胞株或細(xì)胞爬片。注：細(xì)胞爬片不宜太密；細(xì)胞固定。組織切片，一抗

　　五、公司提供

　　基本實(shí)驗(yàn)步驟、藥品、樣品處理、圖片及圖片分析，熒光顯微鏡或共聚焦顯微鏡拍攝

　　實(shí)驗(yàn)周期：1-3周