簡(jiǎn)要描述:甲基化檢測(cè) DNA甲基化是最早發(fā)現(xiàn)的基因表觀修飾方式之一,真核生物中的甲基化僅發(fā)生于胞嘧啶,即在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶(DNMTs)的作用下使CpG二核苷酸5’-端的胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)?’-甲基胞嘧啶。DNA甲基化通常抑制基因表達(dá),去甲基化則誘導(dǎo)了基因的重新活化和表達(dá)。這種DNA修飾方式在不改變基因序列前提下實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控。
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1.甲基化特異性的PCR(Methylation-specific PCR,MSP)
用亞硫酸氫鹽處理基因組DNA,所有未發(fā)生甲基化的胞嘧啶被轉(zhuǎn)化為nmd,而甲基化的胞嘧啶不變;隨后設(shè)計(jì)針對(duì)甲基化和非甲基化序列的引物進(jìn)行PCR。通過(guò)電泳檢測(cè)MSP擴(kuò)增產(chǎn)物,如果用針對(duì)處理后甲基化DNA鏈的引物能得到擴(kuò)增片段,則說(shuō)明該位點(diǎn)存在甲基化;反之,說(shuō)明被檢測(cè)的位點(diǎn)不存在甲基化。
2.亞硫酸氫鹽測(cè)序法(Bisulfite sequencing PCR,BSP)
用亞硫酸氫鹽處理基因組DNA,則未發(fā)生甲基化的胞嘧啶被轉(zhuǎn)化為nmd,而甲基化的胞嘧啶不變。隨后設(shè)計(jì)BSP引物進(jìn)行PCR,在擴(kuò)增過(guò)程中nmd全部轉(zhuǎn)化為胸腺嘧啶,最后對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序就可以判斷CpG位點(diǎn)是否發(fā)生甲基化稱為BSP-直接測(cè)序方法。將PCR產(chǎn)物克隆至載體后進(jìn)行測(cè)序,可以提高測(cè)序成功率,這種方法稱為BSP-克隆測(cè)序法。
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