簡(jiǎn)要描述:TUNEL技術(shù)可對(duì)組織或細(xì)胞中凋亡小體或單個(gè)凋心細(xì)胞進(jìn)行染色,能準(zhǔn)確反映細(xì)胞凋亡最典型的生物化學(xué)和形態(tài)特征。凋亡細(xì)胞內(nèi)內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶被激活而將自身染色體DNA切斷成缺口或3-OH末端片段這一特點(diǎn),利用脫氧核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶將標(biāo)有標(biāo)記物的脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移到3-0H末端,再用免疫組化法或免疫熒光檢測(cè)凋亡細(xì)胞。上海伊萊博致力于臨床前藥效學(xué)CRO實(shí)驗(yàn),有著多年的TUNEL檢測(cè)技術(shù)服務(wù)的經(jīng)驗(yàn)
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1.用二甲苯浸洗2次,每次5min;
2.用梯度7醇(100.95.90.80、70%)各浸洗1次,每次3min:注:上面兩步是針對(duì)石蠟切片樣木的外理
3.用Proteinase K作液外理組織15 30 min 在21-370(溫度、時(shí)間、濃度均需摸索)或者加細(xì)胞通透液8min
4.PBS漂洗2次;
5.制備TUNEL反應(yīng)混合液,處理組用50ulTdT+450ul 熒光素標(biāo)記的dUTP液混勻;而陰性對(duì)照組僅加50ul 熒光素標(biāo)記的dUTP液,陽性對(duì)照組先加入100ul DNase 1,反應(yīng)在15~25℃x10min,后面步驟同處理組。
6.玻片干后,加50uI TUNEL反應(yīng)混合液(陰性對(duì)照組僅加50u熒光素標(biāo)記的dUTP液)于標(biāo)本上,加蓋玻片或封口膜在暗濕盒中反應(yīng)37℃x1h。
7.PBS漂洗3次;
8. 可以加1滴PBS在熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞(激發(fā)光波長(zhǎng)為450~500nm,檢測(cè)波長(zhǎng)為515~565nm);
9.玻片干后加50ul converter-POD干標(biāo)本上,加蓋玻片或封口膜在暗濕盒中反應(yīng)37°cx30min.
10.PBS漂洗3次,
11.在組織處加50~100uIDAB底物,反應(yīng)15~25℃℃x10min;
12.PBS漂洗3次;
13.拍照后再用蘇木素或電其綠復(fù)染,幾秒后立即用自來水沖洗。梯度灑精脫水,二電苯透明,中性樹膠封片。
14.加一滴PBS或甘油在視野下,用光學(xué)顯微錯(cuò)觀察凋廣細(xì)胞(共計(jì)200~500個(gè)細(xì)胞)并拍照,可結(jié)合調(diào)廣細(xì)胞形太特征來綜合判斷(未染色細(xì)胞變小,胞膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象,晚期出現(xiàn)凋亡小體,貼壁細(xì)胞出現(xiàn)鄒縮、變圓、脫落;而染色細(xì)胞呈現(xiàn)染色質(zhì)濃縮、邊緣化,核膜裂解,染色質(zhì)分割成塊狀/凋亡小體。
我們擁有專業(yè)的實(shí)驗(yàn)室、精良的實(shí)驗(yàn)設(shè)備和經(jīng)驗(yàn)豐富的科研技術(shù)人員。技術(shù)團(tuán)隊(duì)包括研究員(博士后)2人,助理研究員(博士)4人,核心研究員(碩士)15人,主要致力于基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)、生物化學(xué)、病理檢測(cè)、基因檢測(cè)等技術(shù)在科研中的應(yīng)用與推廣。通過高度細(xì)分、較好的的服務(wù)平臺(tái),為廣大客戶提供了完善的技術(shù)解決方案和服務(wù)。目前,及,涉及臨床醫(yī)學(xué)、腫瘤生物學(xué)、免疫學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)等生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)等諸多領(lǐng)域。
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