原代細(xì)胞分離

　　原代細(xì)胞分離

　　一、細(xì)胞培養(yǎng)

　　1.取材在無菌環(huán)境下從機(jī)體取出某種組織細(xì)胞（視實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩ǎ?jīng)過的處理（如消化分散細(xì)胞、分離等）后接入培養(yǎng)器血中，這一過程稱為取材。如是細(xì)胞株的擴(kuò)大培養(yǎng)則無取材這一過程。機(jī)體取出的組織細(xì)胞的初次培養(yǎng)稱為原代培養(yǎng)。

　　2.培養(yǎng)將取得的組織細(xì)胞接入培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板中的過程稱為培養(yǎng)。3凍存及復(fù)蘇（可參閱后面有關(guān)章節(jié)）為了保存細(xì)胞，特別是不易獲得的突變型細(xì)胞或細(xì)胞株，要將細(xì)胞凍存。凍存的溫度一般用液氮的溫度－196℃，將細(xì)胞收集至凍存管中加入含保護(hù)劑（一般為二甲亞砜或甘油）的培養(yǎng)基，以的冷卻速度凍存，終保存于液氮中。在極低的溫度下，細(xì)胞保存的時間是無限的。復(fù)蘇一般采用快融方法，即從液氮中取出凍存管后，立即放入37℃水中，使之在一分鐘內(nèi)迅速融解。然后將細(xì)胞轉(zhuǎn)入培養(yǎng)器皿中進(jìn)行培養(yǎng)。

　　二、原代細(xì)胞分離

　　凡是來源于胚胎、組織器官及外周血，經(jīng)特殊分離方法制備而來的原初培養(yǎng)的細(xì)胞稱之為原代細(xì)胞。1懸浮細(xì)胞的分離方法組織材料若來自血液、羊水、胸水或腹水的懸液材料，簡單的方法是采用1000r/min的低速離心10分鐘。經(jīng)離心后由于各種細(xì)胞的比重不同可在分層液中形成不同層，這樣可根據(jù)需要收獲目的細(xì)胞。2實(shí)體組織材料的分離方法對于實(shí)體組織材料，由于細(xì)胞間結(jié)合緊密，為了使組織中的細(xì)胞充分分散，形成細(xì)胞懸液，可采用機(jī)械分散法（物理裂解）和消化分離法。

　　三、細(xì)胞增殖檢測技術(shù)

　　目前主要有兩種用于檢測細(xì)胞增殖能力的方法。一種是直接的方法，通過直接測定進(jìn)行分裂的細(xì)胞數(shù)來評價(jià)細(xì)胞的增殖能力。另一種是間接的方法，即細(xì)胞活力（cellviability）檢測方法，通過檢測樣品中健康細(xì)胞的數(shù)目來評價(jià)細(xì)胞的增殖能力。顯然，細(xì)胞活力檢測法并不能證明檢測樣品中的細(xì)胞是否在增殖。如細(xì)胞在某一培養(yǎng)條件下會自發(fā)啟動凋亡程序，但藥物的干擾可抑制凋亡的發(fā)生；這時若采用細(xì)胞活力檢測法，顯然可以區(qū)分兩種條件下的細(xì)胞數(shù)量，但我們并不能從藥物干擾組細(xì)胞數(shù)大于對照組的事實(shí)說明藥物可促進(jìn)細(xì)胞增殖的結(jié)論。所以直接的證據(jù)應(yīng)該采用方法一。

　　其中常見檢測：CCK8檢測法，MTT檢測法，Brdu檢測法，Edu檢測法，平板克隆形成。

　　四、細(xì)胞周期檢測技術(shù)

　　細(xì)胞周期指由細(xì)胞分裂結(jié)束到下一次細(xì)胞分裂結(jié)束所經(jīng)歷的過程，所需的時間叫細(xì)胞周期時間。

　　常用的方法：流式檢測細(xì)胞周期，標(biāo)記有絲分裂百分率法。

　　五、細(xì)胞凋亡檢測

　　常見檢測方法：流式檢測細(xì)胞凋亡，線粒體膜電位，活性氧檢測，Hoechst染色，電鏡，TUNEL。

　　六、細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力檢測

　　常見檢測方法：細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)，Transwell實(shí)驗(yàn)，Invasion實(shí)驗(yàn)

　　七、其他實(shí)驗(yàn)

　　細(xì)胞惡性程度：軟瓊脂實(shí)驗(yàn)

　　細(xì)胞屏障：跨膜電阻、熒光黃透過率、細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)、共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)、裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)。