流式細(xì)胞檢測(cè)實(shí)驗(yàn)

　　流式細(xì)胞檢測(cè)實(shí)驗(yàn)分類(lèi)

　　1、流式細(xì)胞術(shù)（FlowCytometry，F(xiàn)CM）：

　　就是對(duì)在高速流動(dòng)的鞘液包裹下的細(xì)胞、粒子進(jìn)行分析和分選的技術(shù)，這種細(xì)胞或粒子是經(jīng)過(guò)特異熒光標(biāo)記的。其特點(diǎn)是測(cè)量速度快，每秒鐘能測(cè)數(shù)千個(gè)乃*萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，且可進(jìn)行多參數(shù)測(cè)量，另一特點(diǎn)是在分析的同時(shí)可把具有特征的細(xì)胞分離出來(lái)，這就是分選技術(shù)。

　　流式細(xì)胞檢測(cè)實(shí)驗(yàn)重要參數(shù)：前向角散射（FSC）：前向角散射光的強(qiáng)度與細(xì)胞的大小有關(guān)，也就是說(shuō)，同一個(gè)細(xì)胞群體，F(xiàn)SC強(qiáng)的，其細(xì)胞大一些，而FSC弱的，其細(xì)胞小一些。側(cè)向角散射（SSC）：側(cè)向角散射又稱(chēng)90°散射或大角散射。側(cè)向角散射光對(duì)細(xì)胞膜、胞質(zhì)、核膜的折射率更為敏感，對(duì)胞內(nèi)較大的顆粒也會(huì)有反應(yīng)。所以，側(cè)向角散射光的強(qiáng)弱可反應(yīng)細(xì)胞內(nèi)精細(xì)結(jié)構(gòu)和顆粒的性質(zhì)。熒光信號(hào)（FL）：是細(xì)胞或細(xì)胞上的熒光染料被激光激發(fā)后發(fā)射出的熒光，不同的熒光染料其發(fā)射波長(zhǎng)不同。通過(guò)熒光強(qiáng)度可將同一個(gè)細(xì)胞群體中的有熒光標(biāo)記的細(xì)胞與無(wú)熒光標(biāo)記的細(xì)胞區(qū)分開(kāi)來(lái)，也就是我們通常所說(shuō)的陽(yáng)性細(xì)胞，也可以將陽(yáng)性細(xì)胞中的高FL的細(xì)胞與低FL的細(xì)胞區(qū)分開(kāi)來(lái)，也就是可以把強(qiáng)陽(yáng)性細(xì)胞和弱陽(yáng)性細(xì)胞區(qū)分開(kāi)來(lái)。一般的流式細(xì)胞儀只裝有一個(gè)激光光源（488nm），可測(cè)出三個(gè)FL，即FL1、FL2、FL3。FL2-W指檢測(cè)熒光的脈沖寬度，區(qū)分單個(gè)細(xì)胞和雙聯(lián)體細(xì)胞FL2-H指脈沖高度，細(xì)胞單位面積上的熒光濃度FL2-A指脈沖面積，即細(xì)胞熒光總和。

　　2、細(xì)胞周期檢測(cè)：

　　細(xì)胞內(nèi)的DNA含量隨著細(xì)胞周期進(jìn)程發(fā)生周期性變化。利用PI標(biāo)記的方法，通過(guò)流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞內(nèi)DNA的相對(duì)含量進(jìn)行測(cè)定，可分析細(xì)胞周期各時(shí)相的百分比，反映細(xì)胞的增殖狀態(tài)和非二倍體（異倍體）的DNA含量。其中PI即碘化丙錠，可以與細(xì)胞內(nèi)DNA和RNA結(jié)合，采用RNA抑制劑將RNA消化后，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)與DNA結(jié)合的PI的熒光強(qiáng)度直接反映了細(xì)胞內(nèi)DNA含量的多少。

　　3、細(xì)胞增殖檢測(cè)

　　示蹤染料標(biāo)記法：示蹤染料能與細(xì)胞發(fā)生非特異性的穩(wěn)定結(jié)合，主要有兩種結(jié)合方式：進(jìn)入胞內(nèi)與蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)合，如CFSE和BRSE；嵌入細(xì)胞膜的磷脂雙分子層，與細(xì)胞非公價(jià)結(jié)合，如PKH類(lèi)和CellVue類(lèi)等。CFSE是活細(xì)胞染料，又稱(chēng)CFDA-SE或CFDA，其標(biāo)記細(xì)胞后對(duì)細(xì)胞毒性小，被激發(fā)后能發(fā)出很強(qiáng)熒光，且非常穩(wěn)定，只有當(dāng)細(xì)胞分裂時(shí)，母細(xì)胞內(nèi)的染料會(huì)被平均分配到子細(xì)胞中，細(xì)胞的熒光信號(hào)減少一半，細(xì)胞分裂代數(shù)越多，信號(hào)降低程度越大。

　　4、細(xì)胞因子檢測(cè)

　　細(xì)胞因子是一類(lèi)能在細(xì)胞間傳遞信息、具有免疫調(diào)節(jié)和效應(yīng)等功能的蛋白或小分子多肽。根據(jù)功能可分為六大類(lèi)：白細(xì)胞介素、干擾素、集落刺激因子、腫瘤壞死因子、生長(zhǎng)因子和趨化因子。胞內(nèi)細(xì)胞因子：胞內(nèi)染色法（intracellularstainingassay）；胞間細(xì)胞因子：CBA法（cytometricbeadassay，流式微球陣列）。其優(yōu)點(diǎn)為單細(xì)胞水平，可多參數(shù)檢測(cè)。