大腦皮層神經(jīng)元原代培養(yǎng)的步驟你有去了解過(guò)嗎？

　　大腦皮層神經(jīng)元原代培養(yǎng)是將胚胎哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的部分組織，如大腦皮層、海馬、脊髓等腦組織直接取出，再接種培養(yǎng)的方法。目前國(guó)內(nèi)、外有關(guān)神經(jīng)元培養(yǎng)的方法較多，但在原代培養(yǎng)中神經(jīng)元的純度和產(chǎn)量方面還存在一些急待解決的問(wèn)題。由于神經(jīng)元是一種高度分化的細(xì)胞，相對(duì)于其它細(xì)胞而言，神經(jīng)元在體外更難以存活和生長(zhǎng)。因此，體外培養(yǎng)神經(jīng)元要求的培養(yǎng)方法和營(yíng)養(yǎng)條件均較為特殊。

　　大腦皮層神經(jīng)元原代培養(yǎng)的步驟：

　　1、于無(wú)菌條件下切取鼠頭并以75%酒精浸泡1min，解剖出完整鼠腦；

　　2、預(yù)冷解剖液中分離去除軟膜、血管、取大腦皮質(zhì)漂洗，用眼科剪將皮質(zhì)反復(fù)剪切成碎塊；

　　3、移入培養(yǎng)皿中，吸除解剖液加入0.25%胰蛋白酶2m1，37℃培養(yǎng)箱中消化30min；

　　4、將皮層組織碎塊移入離心管，棄去剩余消化液，用接種液洗3次，每次洗滌后使組織塊充分沉降到試管底，棄去上清液；

　　5、最后再用接種液1ml混懸，反復(fù)吹打（巴氏吸管）混懸液中組織塊，力度適中，至渾濁后將上清液移入培養(yǎng)瓶待用；

　　6、加入1ml接種液后再次吹打，如此反復(fù)3-4次，組織塊逐漸消化后，棄去最終殘塊；

　　7、收集含單細(xì)胞懸液的上清液約4-5ml于培養(yǎng)瓶中，以接種液重新懸浮細(xì)胞，細(xì)胞記數(shù)；接種1x107個(gè)細(xì)胞于6孔培養(yǎng)板中；

　　8、培養(yǎng)24h至細(xì)胞貼壁后，換全培養(yǎng)液（DMEM/F12+2%B27，engreen）培養(yǎng)3d，觀察神經(jīng)元生長(zhǎng)狀況；

　　9、換用阿糖胞苷培養(yǎng)液(終濃度2.5ug/ml，換半液)培養(yǎng)3d以抑制神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞及雜細(xì)胞生長(zhǎng)，獲得單純培養(yǎng)的原代神經(jīng)細(xì)胞；

　　10、每隔3d換全培養(yǎng)液1次，每次換半液。