研究背景:
細胞不斷感知和響應(yīng)微環(huán)境中的生化和生物力學變化,需要動態(tài)代謝適應(yīng)。細胞外基質(zhì)(ECM)硬化是癌癥侵襲性的標志,而基質(zhì)剝離下的生存也與不良預(yù)后相關(guān)。細胞通過整合素共軛結(jié)合的焦點附著斑(FAs) 感知ECM的物理特性,影響細胞遷移、分化和存活。由于組織纖維化和ECM硬化與腫瘤預(yù)后不良相關(guān),通過膠原蛋白消耗或賴氨酸氧化酶(LOX)抑制或藥物改變細胞機械轉(zhuǎn)導來抑制ECM硬化已成為癌癥治療的有希望的選擇。腫瘤細胞如何在堅硬的基質(zhì)上獲得生長優(yōu)勢,而在基質(zhì)脫離時抵抗失巢凋亡死亡仍然是一個謎,其作用機制仍不清楚。
失巢凋亡是一種特殊形式的程序性細胞死亡。正常貼壁生長的細胞在失去與細胞外基質(zhì)(ECM)的黏附或細胞間相互接觸受到破壞后,因無法從周圍環(huán)境中獲得生存信號而啟動的一種細胞凋亡程序。腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移是一個復(fù)雜的多步驟過程,其中包括腫瘤細胞從原發(fā)腫瘤組織脫離、侵入周圍組織、進入血液循環(huán)或淋巴循環(huán)、在遠處器官黏附和定植等環(huán)節(jié)。失巢凋亡在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中起著重要的屏障作用。正常情況下,脫離原發(fā)腫瘤組織的腫瘤細胞由于失去了與細胞外基質(zhì)的黏附,應(yīng)該發(fā)生失巢凋亡而死亡,從而限制了腫瘤細胞的擴散。然而,腫瘤細胞往往通過多種方式逃避失巢凋亡,這使得其能夠在血液循環(huán)中存活并轉(zhuǎn)移到遠端器官,形成轉(zhuǎn)移灶。
在本研究中,研究人員詳細介紹了整合素/GSK3 β/FTO/MTOR軸在乳腺癌進展中的作用:乳腺癌細胞通過該信號軸整合剛度感知,以確保剛性基質(zhì)賦予的生長優(yōu)勢和基質(zhì)剝離下細胞的抗失巢凋亡能力。
圖1 作用模式圖
研究結(jié)果:
1. 基質(zhì)硬化激活mTORC1通路,促進細胞生長
研究的結(jié)果表明,在剛性培養(yǎng)條件下,使用mTORC1抑制劑雷帕霉素和/或肌球蛋白II抑制劑blebbistatin抑制細胞收縮力后,細胞生長顯著降低。RNA-Seq的分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)在硬基質(zhì)培養(yǎng)條件下的上調(diào)特征基因富集在mTORC1信號通路。此外,與軟基質(zhì)相比,多種細胞在硬基質(zhì)條件下的phos-S6水平顯著增加,而總S6水平?jīng)]有明顯變化。同時,AKT和AMPKα磷酸化水平無顯著差異,這表明mTORC1在硬化條件下激活的特異性。
圖2 硬基質(zhì)培養(yǎng)條件下mTORC1激活介導細胞生長
2. mTORC1在硬基質(zhì)上的激活受基于整合素的FAs調(diào)控
為研究FAs是否參與底物剛度誘導的mTORC1激活,研究人員首先使用免疫熒光染色,檢測到mTOR/Phos-S6與FA標記蛋白paxillin或vinculin在硬基質(zhì)而不是軟基質(zhì)上的強共定位。而使用blebbistatin干擾硬基質(zhì)培養(yǎng)細胞的細胞收縮性時,共聚焦和超分辨率STED成像表明mTOR和phos-S6的特異性FA定位消失。表明FAs在硬基質(zhì)誘導的mTORC1激活中起關(guān)鍵作用。
圖3 mTORC1在硬基質(zhì)上的激活受基于整合素的FAs調(diào)控
此外,mTOR蛋白質(zhì)水平和mTORC1活性的同時減低只在敲低??1整合蛋白時發(fā)生。同時,整合素??1的敲低阻礙了mTOR/phos-S6和paxillin在硬基質(zhì)上的共定位,并降低了 mTORC1的活性。這些結(jié)果揭示了整合素??1在基質(zhì)硬度介導的mTORC1激活中的重要作用。
3. 軟基質(zhì)通過調(diào)節(jié)m6A RNA甲基化降低mTOR蛋白豐度
進一步的研究發(fā)現(xiàn)軟基質(zhì)上的細胞或敲低黏著斑蛋白顯著降低mTOR蛋白水平,而Raptor、mLST8或DEPDC6豐度無變化。MG132在對照組中導致mTOR蛋白的積累。而在blebbistatin處理的細胞中,這種增加被減弱;這暗示在低收縮力下,mTOR蛋白的合成可能受到阻礙,導致總mTOR降低,而兩組間mTOR降解無明顯差異。表明在軟基質(zhì)下mTOR水平的下降,收縮力的降低是由于蛋白合成受到抑制而非降解增強引起的。
圖4 基質(zhì)剛性調(diào)節(jié)mTOR豐度和m6A水平
此外,blebbistatin干預(yù)后mTOR mRNA減少,但熒光素酶報告基因檢測mTOR mRNA轉(zhuǎn)錄能力時,在blebbistatin干預(yù)后無顯著差異。相比之下,使用放線菌素D阻斷 RNA合成并監(jiān)測 mRNA穩(wěn)定性時, blebbistatin干預(yù)后 mTOR mRNA的降解速度明顯加快。使用SRAMP軟件在線預(yù)測了位于mTOR mRNA 3'UTR的5個非常高置信度的m6A修飾位點,在blebbistatin治療后,Me-RIP qPCR的結(jié)果顯示所有五個位點都表現(xiàn)出升高的m6A修飾。這些數(shù)據(jù)表明剛性敏感的m6A變化可能介導mTOR蛋白豐度在不同剛度或細胞收縮性條件下的改變。
4. FTO磷酸化鏈接剛性傳感與mTOR m6A修飾
隨后,研究人員分析了甲基化酶/去甲基化酶METTL3、METTL14、WTAP、VIRMA、FTO和ALKBH5的干擾對硬基質(zhì)和軟基質(zhì)條件下mTOR和phos-S6蛋白變化的影響。發(fā)現(xiàn)FTO是參與mTOR m6A修飾的去甲基化酶。RIP-qPCR的結(jié)果表明,blebbistatin處理的細胞中mTOR mRNA被FTO富集較對照組減少。表明mTOR mRNA和FTO之間的相互作用可能在低收縮性下被破壞,留下更多的m6A修飾完整而沒有有效擦除。在不同硬度下,F(xiàn)TO的亞細胞定位和蛋白水平均未見明顯變化,而在blebbistatin處理的細胞中,F(xiàn)TO泛磷酸化絲氨酸水平升高,進一步發(fā)現(xiàn)FTO的Ser 256位點磷酸化修飾是FTO調(diào)控mTORC1的關(guān)鍵。
5. GSK3β定位在FA區(qū)域,磷酸化FTO激活mTORC1
人類FTO中的重復(fù)共識基序“256S/T- e - dd -S/T(P)260" 與GSK3的底物識別基序 “S/T- x - x - x -S/T(P)"相匹配。實驗表明,使用CHIR-98014 抑制GSK3β可降低FTO的磷酸化,而通過降低細胞張力激活FTO則會產(chǎn)生相反的效果;同時發(fā)現(xiàn)CHIR-98014處理軟基質(zhì)培養(yǎng)的細胞后,phos-S6水平恢復(fù)。此外,免疫共沉淀的結(jié)果表明,F(xiàn)TO與GSK3β存在直接結(jié)合。GSK3的亞細胞定位研究發(fā)現(xiàn),GSK3在細胞質(zhì)中主要是彌漫性的,但在細胞的腹側(cè)顯示斑塊樣結(jié)構(gòu),與paxillin在FA位點共定位。
圖5 GSK3通過與整合素的相互作用,在磷酸化FTO中起著重要作用
而錳離子增加了GSK3的ser9上的磷酸化;同時,在硬底物與軟底物上培養(yǎng)的細胞中phos-GSK3 (Ser9)升高,但總GSK3水平?jīng)]有顯著變化。這些結(jié)果確定了GSK3在基質(zhì)強度誘導的FTO和mTORC1激活中的潛在作用,以及其潛在機制可能涉及整合素??1。
5. ECM脫離過程中mTORC1調(diào)節(jié)細胞自噬的作用機制
ECM脫離,相當于一個極其柔軟的基質(zhì),已被報道誘導代謝應(yīng)激導致失巢凋亡,自噬可以 保護細胞免受損傷,促進與ECM的再附著,研究在低黏附基質(zhì)上培養(yǎng)MDA-MB-231和MEF細胞時,觀察到LC3B-II水平升高和mTOR及phos-S6水平下降。表明了自噬水平的升高。
圖6 基質(zhì)剛性通過mTORC1信號調(diào)控自噬
隨后,懸浮MEF較貼壁細胞碘化丙啶(PI)染色率,而自噬藥理抑制劑氯喹(CQ)的干預(yù)進一步增強了細胞死亡程度。在雷帕霉素處理的細胞中,細胞死亡的增強明顯減弱。通過血清刺激激活mTORC1后,也觀察到CQ治療對細胞死亡的類似影響。表明基質(zhì)分離能夠通過抑制mTORC1活性增強自噬,從而促進細胞對失巢凋亡的抵抗并提高生存率。此外,在多個腫瘤細胞系中觀察到,LC3B-II蛋白在硬底物或高收縮力的細胞中減少,而在軟底物或低收縮力的細胞中增加;且TEM觀察到低收縮性細胞中自噬體數(shù)量增加,提示軟基質(zhì)上自噬通量增強。另外,TSC2敲除細胞中硬基質(zhì)與軟基質(zhì)上LC3B-II水平的差異減弱。這表明基質(zhì)硬化以mTORC1依賴的方式阻礙自噬。最后,在DCIS患者連續(xù)切片組織樣本中,與正常乳腺上皮相比,分離細胞和腔細胞的LC3B水平更高,而分離細胞和腔細胞中相應(yīng)的mTOR 水平與LC3B呈反相關(guān)。
綜上所述,研究結(jié)果強調(diào)了細胞代謝的雙相機制調(diào)節(jié),與腫瘤在纖維化等硬化條件下的生長以及癌癥轉(zhuǎn)移期間的失巢凋亡抗性有關(guān)。基質(zhì)硬化時可以通過整合素和GSK3β-FTO介導的mRNA m6A修飾激活mTORC1,提高mTOR水平,促進合成代謝;在ECM脫離時抑制該軸增強自噬,進而抑制失巢凋亡促進細胞存活。
文獻給讀者的啟發(fā)在于揭示剛性感知在腫瘤進展中的作用,一方面揭示實體瘤細胞生長中的新機制;另一方面揭示腫瘤轉(zhuǎn)移過程中脫離基質(zhì)后,腫瘤細胞通過自噬抵抗失巢凋亡促進存活的生存策略。這種腫瘤細胞對基質(zhì)微環(huán)境的應(yīng)答機制有助于對腫瘤進展的理解和靶向治療的開發(fā)。
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